Bases+bioquímicas+de+los+métodos+para+la+determinación+de+hormonas+tiroideas+(TSH,+T3+y+T4)

La tiroides es una glándula ubicada en la región anterior del cuello, esta secreta tres hormonas importantes la tiroxina ( tretayodotironina T4) y la triyodotironina (T3) producidas por las células foliculares y la calcitonina por las células parafoliculares. T3 y T4 regulan el metabolismo basal, la producción de calor en la célula y el crecimiento corporal. Estas hormonas a su vez están reguladas por la TSH producida por hipófisis. Determinar estas hormonas, es una manera de cuantificar los niveles séricos de las mismas, para poder así determinar la presencia de patologías que están relacionadas con la cantidad de las mismas en el organismo. (Biokit de Maracaibo, 2004)

El método más utilizado para esto es el denominado ELISA. Este procedimiento, como bien sus siglas en inglés indican, es una técnica de ensayo por inmunoabsorción ligado a enzimas, el cual se basa en el uso de antígenos o anticuerpos marcados con una enzima. Estos componentes marcados son insolubilizados sobre un soporte. La reacción antígeno-anticuerpo, posteriormente será revelada al agregar sustrato que reaccione con la enzima, produciendo así un color cuantificable con un espectrofotómetro.

En general para llevar a cabo este procedimiento se requiere de microplacas de 96 pocillos, micropipetas, lavadores de placa, tubos calibradores y lectores de placa.



__**Procedimiento para cuantificar hormonas tiroideas. **__


 * Tirotropina (TSH): **

La tirotropina es una hormona secretada por la glándula pituitaria anterior, que ejerce efectos sobre la tiroides, para que esta libere hormonas T3 y T4.La concentración de TSH en sangre es bastante baja, pero es de suma importancia para la función tiroidea normal. Su cuantificación en el plasma sanguíneo se utiliza primordialmente para determinar la presencia de hipotiroidismo. El procedimiento utilizado para medir los niveles de esta hormona, es un ELISA tipo sándwich. Según las investigaciones realizadas por la Empresa Grupo Cultek S.L. (2006), los pasos son los siguientes:



Es importante destacar, que paralelamente se realiza un procedimiento en los tubos calibradores en el cual se mide la absorbancia de la hormona TSH a diferentes concentraciones. Esto permite elaborar una curva de calibración, para poder después interpretar con ésta los resultados obtenidos en el procedimiento anterior. Se hace mención que un aumento de la hormona TSH en el plasma sanguíneo puede ser un indicador de hipotiroidismo.




 * T3 libre: **

"El 99,7% de la hormona T3 se encuentra en sangre unida a la proteína fijadora de tiroxina (TBG), albúmina y prealbúmina, el resto circula como T3 libre, la cual es la forma activa de la hormona". (Wild, 2001)

La T3 libre es independiente de las variaciones causadas en estas proteínas, ya sea por embarazo o la terapia con esteroides, por ello es que se utiliza para la determinación de patologías, estableciendo que un aumento de la misma indica hipetiroidismo y una disminución indica hipotiroidismo.

El tipo de ELISA que se utiliza para su determinación es el ELISA competitivo. Éste se realiza de la siguiente manera:

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 * 1) Se fija al pocillo el anticuerpo anti-T3.
 * 1) Se adiciona concentraciones conocidas de la hormona T3 libre de la muestra y también concentraciones de T3 libre unida a la enzima peroxidasa. Estas 2 hormonas van a competir por unirse al anticuerpo; de manera que mientras más T3-peroxidasa se encuentre unido al anticuerpo, menos T3 libre se va a encontrar unido a éste.
 * 1) Se realiza un lavado para eliminar las hormonas que no se unieron.
 * 1) Se agrega una solución de sustrato con peróxido de úrea de hidrógeno, para la enzima peroxidasa. La solución se torna de color azul como consecuencia de la actividad enzimática.
 * 1) Se agrega solución de parada para detener la reacción de la peroxidasa con su sustrato. Esta solución tiene ácido sulfúrico, y causa que la solución previa se vuelva de color amarillo.
 * 1) <span style="display: block; font-family: Arial,Helvetica,sans-serif; font-size: 120%; text-align: justify;">Se mide la absorbancia del producto de la enzima con el lector de micropocillos de ELISA denominado Humareader a 450nm.
 * 1) <span style="display: block; font-family: Arial,Helvetica,sans-serif; font-size: 120%; text-align: justify;">Se realiza la curva de calibración a partir de la absorbancia de T3 a determinadas concentraciones en los tubos calibradores.

<span style="display: block; font-family: Arial,Helvetica,sans-serif; font-size: 120%; text-align: justify;">La interpretación de la curva, consistiría en que a mayor intensidad de color, o a mayor absorbancia, menor va a hacer la concentración de T3 en la muestra.




 * <span style="font-family: Arial,Helvetica,sans-serif; font-size: 130%;">T4 Libre **

<span style="display: block; font-family: Arial,Helvetica,sans-serif; font-size: 120%; text-align: justify;">La hormona T4 en un 99% circula en sangre unida a la proteína TBG; sólo el 1% circula de forma libre. Se cree que la forma libre es la forma activa de la hormona. La T4 libre al igual que la T3 libre, es la que se utiliza para determinar la presencia de patologías. Una alta concentración de la misma, es un signo de presencia de hipertiroidismo, mientras que una baja indica hipotiroidismo. (Biokit de Maracaibo C.A, 2004).

<span style="display: block; font-family: Arial,Helvetica,sans-serif; font-size: 120%; text-align: justify;">El tipo de ELISA que se utiliza para su cuantificación también el de tipo competitivo, y se realiza de la misma manera que la otra hormona, la única diferencia son los elementos utilizados.

<span style="display: block; font-family: Arial,Helvetica,sans-serif; font-size: 120%; text-align: justify;">El procedimiento es el siguiente:

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 * 1) <span style="display: block; font-family: Arial,Helvetica,sans-serif; font-size: 120%; text-align: justify;">Se fija al pocillo el anticuerpo anti-T4.
 * 1) <span style="display: block; font-family: Arial,Helvetica,sans-serif; font-size: 120%; text-align: justify;">Se realiza un lavado para eliminar los anticuerpos que no se fijaron correctamente.
 * 1) <span style="display: block; font-family: Arial,Helvetica,sans-serif; font-size: 120%; text-align: justify;">Se agrega al pocillo concentraciones de T4 libre de la muestra, y T4 unido a la enzima peroxidasa. Estas hormonas van a competir entre sí por el anticuerpo fijado.
 * 1) <span style="display: block; font-family: Arial,Helvetica,sans-serif; font-size: 120%; text-align: justify;">Se realiza un lavado para eliminar las hormonas que no se unieron.
 * 1) <span style="display: block; font-family: Arial,Helvetica,sans-serif; font-size: 120%; text-align: justify;">Se agrega la solución con el sustrato para la peroxidasa. Ésta solución puede contener peróxido de úrea hidrógeno, tetrametilbenzidina (TMB) y buffer de acetato de sodio. La solución se torna azul al igual que la anterior.
 * 1) <span style="display: block; font-family: Arial,Helvetica,sans-serif; font-size: 120%; text-align: justify;">Se vierte el reactivo de parada que contiene ácido sulfúrico, y causa que la solución se vuelva amarilla.
 * 1) <span style="display: block; font-family: Arial,Helvetica,sans-serif; font-size: 120%; text-align: justify;">Se mide la absorbancia del producto de la enzima peroxidasa, con el lector de micropocillos de ELISA (Humareader) a 450nm.
 * 1) <span style="display: block; font-family: Arial,Helvetica,sans-serif; font-size: 120%; text-align: justify;">Se realiza la curva de calibración a partir de la absorbancia de T4 a determinadas concentraciones en los tubos calibradores.

<span style="display: block; font-family: Arial,Helvetica,sans-serif; font-size: 120%; text-align: justify;">La interpretación de la curva consistiría, en que a mayor intensidad de color, o a mayor absorbancia, menor va a hacer la concentración de T4 en la muestra.

<span style="display: block; font-family: Arial,Helvetica,sans-serif; font-size: 120%; text-align: justify;">media type="custom" key="19187788" width="180" height="180" align="left"